SVAR Life Science RUO Wieslab Complement System MBL Pathway

Informació important

• Immunoassaig enzimàtic per a l'avaluació de l'activitat funcional del complement.
• Trencar les tires de microtitulació (12×8) de 96 pous
• Guardeu el kit a +2-8 °C
• Emmagatzemar el control positiu a -20 °C

Document núm. LABEL-DOC-0032, 4.0 Data d'entrada en vigor: 03-maig-2023

NOMÉS PER A ÚS DE RECERCA.
NO PER A ÚS EN PROCEDIMENTS DE DIAGNÒSTIC.

FINALITAT DEL PRODUCTE DE RECERCA

El kit de via MBL del sistema de complements Wieslab® és un immunoassaig enzimàtic per a la determinació qualitativa de la via del complement MBL en sèrum humà, el resultat no s'ha d'utilitzar per al diagnòstic clínic o la gestió del pacient.

El sistema del complement té un paper essencial en les malalties cròniques, autoimmunes i infeccioses. Hi ha tres vies d'activació del complement (fig. 1), a saber, la clàssica, l'alternativa i la via MBL descoberta recentment.

La alteració de l'activitat del complement fa que els humans siguin susceptibles a infeccions fulminants o greus repetitives i pot contribuir al desenvolupament de malalties autoimmunes. L'activació inadequada del complement contribueix a la inflamació crònica i a lesions dels teixits.

Principi de l'assaig del complement Wieslab® 

L'assaig de complement Wieslab® combina els principis de l'assaig hemolític per a l'activació del complement amb l'ús d'anticossos marcats específics per al neoantígen produït com a resultat de l'activació del complement. La quantitat de neoantigen generada és proporcional a l'activitat funcional de les vies del complement.

En el kit Complement system MP, els pous de les tires de microtitulació estan recoberts amb activadors específics de la via MBL. El sèrum del subjecte es dilueix en un diluent que conté un bloquejador específic per assegurar-se que només s'activa la via MBL. Durant la incubació del sèrum subjecte diluït als pous, el complement s'activa mitjançant el recobriment específic.

A continuació, es renten els pous i es detecta C5b-9 amb un anticòs específic marcat amb fosfatasa alcalina contra el neoantigen expressat durant la formació de MAC.

Després d'un altre pas de rentat, s'obté la detecció d'anticossos específics mitjançant la incubació amb una solució de substrat de fosfatasa alcalina. La quantitat d'activació del complement es correlaciona amb la intensitat del color i es mesura en termes d'absorbància (densitat òptica (OD)).

Advertències i precaucions 

• Només per a ús de recerca. No s'utilitza en procediments de diagnòstic
• Els components del sèrum humà utilitzats en la preparació dels controls del kit s'han provat per detectar la presència d'anticossos contra el virus de la immunodeficiència humana 1 i 2 (VIH 1 i 2), l'hepatitis C (VHC) i l'antigen de superfície de l'hepatitis B mitjançant mètodes aprovats per la FDA. i va trobar negatiu. Com que cap mètode de prova pot oferir una garantia completa que el VIH, el VHC, el virus de l'hepatitis B o altres agents infecciosos estan absents, les mostres i els reactius d'origen humà s'han de manipular com si fossin capaços de transmetre agents infecciosos.
• Els Centres per al Control i la Prevenció de Malalties i els Instituts Nacionals de Salut van recomanar que els agents potencialment infecciosos es manipulin al nivell de bioseguretat 2.
• Totes les solucions contenen ProClin 300 com a conservant. No pipeteu mai amb la boca ni permeteu reactius o pacientsampque entri en contacte amb la pell. Els reactius que contenen ProClin poden ser irritants. Eviteu el contacte amb la pell i els ulls. En cas de contacte, rentar amb aigua abundant.
• Les fitxes de dades de seguretat dels materials per a tots els components perillosos continguts en aquest kit estan disponibles a petició de Svar Life Science.
  Solució de rentat (30x Conc.)

 ADVERTIMENT

Conté

Massa de reacció de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [EC núm. 247-500-7] i 2-metil-2H-isotiazol-3-ona [EC núm. 220-239-6] (3:1)

H317 Pot provocar una reacció al·lèrgica a la pell.
H412 Nociu per a la vida aquàtica amb efectes duradors.
P261 Eviteu respirar l'esprai.
P273 Eviteu l'alliberament al medi ambient.
P280 Utilitzeu guants de protecció.
P333 + P313 Si es produeix irritació o erupció cutània: Demaneu assessorament/atenció mèdica.
Tampó de dilució MP, solució conjugada, control negatiu, substrat pNPP
EUH208 Conté “Massa de reacció de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [EC núm. 247-500-7] i 2-metil-2H-isotiazolin-3-ona [EC núm. 220-239-6] (3:1)” Pot produir una reacció al·lèrgica.
EUH210: Fitxa de dades de seguretat disponible a petició.

Recollida d'exemplars 

Sang sampLes dades s'han de recollir mitjançant la tècnica de venopunció asèptica i el sèrum obtingut mitjançant procediments estàndard. Es recomana un mínim de 5 ml de sang sencera. Deixeu que la sang coaguli en tubs de sèrum durant 60-65 minuts a temperatura ambient (20-25 °C). Centrifugar sang sampi transferir el sèrum sense cèl·lules a un tub net. Els sèrums s'han de manipular correctament per evitar l'activació del complement in vitro. Els sèrums s'han de congelar a -70 ° C o menys en tubs ben tancats per a un emmagatzematge prolongat o per al transport sobre gel sec. Sampno s'han de congelar i descongelar més d'una vegada. Evitar l'ús de sèrums icterics, lipèmics i hemolitzats. Els sèrums inactivats per calor no es poden utilitzar. No es pot utilitzar plasma. El NCCLS proporciona recomanacions per emmagatzemar mostres de sang (Procediments estàndard aprovats per a la manipulació i processament de mostres de sang, H18A, 1990).

Components del kit i emmagatzematge de reactius

• Un marc amb colourlEss pous separables (12×8) segellats en un paquet d'alumini amb un sobre de dessecació. Els pous han estat recoberts de manà.
• 35 mL Diluent MP (Dil MP), etiquetat de color verd.
• Conjugat de 13 ml que conté anticossos marcats amb fosfatasa alcalina contra C5b-9 (color blau).
• 13 ml de solució de substrat llesta per utilitzar.
• Solució de rentat de 30 ml concentrada 30 vegades.
• 0.2 ml de control negatiu (NC) que conté sèrum humà (que s'ha de diluir com per a sèrum subjecte).ample).
• 0.2 ml de control positiu (PC) que conté sèrum humà sec congelat, vegeu "Reconstitució del control positiu", a continuació.

Tots els reactius del kit estan preparats per al seu ús, excepte la solució de rentat i els controls. Els reactius s'han d'emmagatzemar a 2-8°  C excepte el control positiu.

El control positiu s'ha d'emmagatzemar a:20°C.

Materials o equipament necessaris però no subministrats

• Lector de microplaques amb filtre 405 nm.
• Pipetes de precisió amb puntes d'un sol ús.
• Rentadora per a tires, teixit absorbent, tubs i temporitzador

PROCEDIMENT

Traieu només el nombre de pous necessaris per a la prova, tornant a segellar el paquet d'alumini amb cura. Deixeu que totes les solucions s'equilibrin a temperatura ambient (20-25 °C) abans de l'anàlisi.

Preparació de la solució de rentat

En cas que s'observin cristalls de sal a l'ampolla amb la solució de rentat concentrada, col·loqueu l'ampolla al bany maria a 37 °C fins que els cristalls s'hagin dissolt abans de diluir la solució de rentat. Diluïu 30 ml de la solució de rentat concentrada 30x en 870 ml d'aigua destil·lada. Quan s'emmagatzema a 2-8 ° C, la solució de rentat diluïda és estable fins a la data de caducitat del kit.

Reconstitució del control positiu

Toqueu suaument tot el material liofilitzat al fons del vial i traieu la tapa. Afegiu immediatament 200 µL d'aigua destil·lada directament al material liofilitzat. Substituïu la tapa. Deixeu reposar el vial sobre gel durant 5 minuts i després agiteu-lo suaument o agiteu-lo de tant en tant fins que es dissolgui completament. Diluir el control reconstituït de la mateixa manera que un sèrum subjecte sample. El control reconstituït es pot emmagatzemar fins a 4 hores abans de l'ús si es manté a 2-8 ° C o en gel. Es pot congelar a -70 °C i descongelar una vegada.

Sèrum

Descongelar parcialment els sèrums congelats col·locant-los breument en un bany maria a 37 °C amb una barreja suau. Després de descongelar parcialment, col·loqueu immediatament els tubs en un bany de gel i deixeu-los sobre gel fins que estiguin completament descongelats. Barrejar breument amb una batedora vòrtex.

Dilució del sèrum

Diluïu el sèrum 1/101 amb Diluent MP, etiqueta verda, (500 µl de diluent + 5 µl de sèrum). El sèrum diluït s'ha de deixar a temperatura ambient durant >15 minuts abans de l'anàlisi, però no més de 60 minuts.

Incubació del samples

Pipeteu 100 µL/pou per duplicat de Diluent (Dil) com a blanc, control positiu (PC), control negatiu (NC) i sèrum del subjecte diluït (P) per a cada via segons el diagrama. Incubar durant 60-70 minuts a +37ºC amb tapa.

Tingueu en compte que no s'ha de realitzar cap incubació sota atmosfera de CO2. Si s'utilitza un armari de CO2, assegureu-vos que el subministrament de CO2 estigui desconnectat/apagat.

Via MBL

	1	2	3
A B C D E F G H	Dil MP	P2
	Dil MP	P2
	PC	etc
	PC
	NC
	NC
	P1
	P1

Després de la incubació sèrica

Buidar els pous i rentar 3 vegades amb 300 µL de solució de rentat, omplint i buidant els pous cada vegada. Després de l'últim rentat, buidar els pous tocant la tira sobre un teixit absorbent.

Afegint conjugat

Afegiu 100 µL de conjugat a cada pou. Incubar durant 30 minuts a temperatura ambient (+20-25 °C).

Després de la incubació conjugada
Rentar 3 vegades com abans.

Afegir solució de substrat

Afegiu 100 µL de solució de substrat a cada pou, incubeu durant 30 minuts a temperatura ambient (+20-25 °C). Llegiu l'absorbància a 405 nm en un lector de microplaques. (Es pot utilitzar EDTA 5 mM com a solució de parada, 100 µL/pou. Llegiu l'absorbància dels pous en 60 minuts.)

Càlcul del resultat

Resteu l'absorbància del blanc (diluent) del NC, el PC i el samples. L'absorbància del control positiu ha de ser > 1 i l'absorbància del control negatiu < 0.2. Els controls negatius i positius es poden utilitzar de manera semiquantitativa per calcular l'activitat del complement. Calculeu els valors mitjans OD405nm per al sample, PC i NC i calculeu el % d'activitat del complement de la següent manera: (Sample-NC)/(PC-NC)x100. Els controls negatius i positius estan destinats a controlar si hi ha una fallada substancial dels reactius. El control positiu no garantirà la precisió al tall de l'assaig. Es recomana que cada laboratori estableixi el seu propi nivell de referència i valor de tall per a les deficiències.
Un resultat negatiu, és a dir, una deficiència, sempre s'ha de verificar provant un nou sampper garantir que no s'ha produït cap activació del complement in vitro.

Resultats de la matèria

L'activació in vitro de la seqüència del complement comporta el consum de components del complement que, al seu torn, provoca una disminució de la seva concentració. Així, la determinació de les proteïnes del complement o de l'activitat del complement s'utilitza per indicar si el sistema del complement ha estat activat per un mecanisme immunològic i/o patogènic. Les mesures del complement tant funcional com immunoquímica s'utilitzen per avaluar pacients quan se sospita una malaltia activadora del complement o és possible una deficiència hereditària. El nivell d'activitat del complement avaluat mitjançant assajos funcionals com el kit de complement Wieslab® té en compte la velocitat de síntesi, degradació i consum dels components i proporciona una mesura de la integritat de les vies en contraposició als mètodes immunoquímics que mesuren específicament la concentració. de diferents components del complement. Quan es troben nivells reduïts dels components del complement o de la funció del complement, els metges consideren una deficiència o un procés immunològic en curs, que condueix a una major degradació dels components i una depressió dels nivells del complement. Els nivells de complement augmentats solen ser una expressió inespecífica d'una resposta de fase aguda.
El sistema de complements Wieslab® MBL Pathway pot ser útil per a la detecció de deficiències del complement relacionades amb la via MBL, tal com es mostra a la taula següent: Es pot aconseguir una avaluació funcional més completa i en profunditat de les tres vies del complement mitjançant Wieslab® Complement System Screen. .

Via clàssica	Via MBL	Via alternativa	Possible deficiència
Positiu	Positiu	Positiu	Cap
Negatiu	Positiu	Positiu	C1q, C1r, C1s
Positiu	Positiu	Negatiu	Properdin, Factor B, D
Positiu	Negatiu	Positiu	MBL, MASP2
Negatiu	Negatiu	Negatiu	C3, C5, C6, C7, C8, C9
Negatiu	Negatiu	Positiu	C4, C2 o combinació

Característiques de rendiment

Es van provar 120 sèrums de donants de sang en l'assaig MP i es va calcular el rang de referència normal. Els valors es van expressar en % del control positiu. Vegeu la figura 1 i la taula 1. A l'estudi, 23 samples estaven per sota del 10% i tenien valors de MBL (establerts en un assaig separat) per sota de 500 ng/mL. Tingueu en compte que la MP deficient real, és a dir, una activitat de <10%, es pot trobar en una població normal amb una freqüència del 20-30%.

Figura 1.

Taula 1.

	n	Significar (%)	±2 SD (%)	Mediana (%)
Via MBL	120	49	0-125	56

Taula 2

En l'assaig es van provar sèrums amb deficiències de complement conegudes i es van obtenir els resultats següents. Tots els sèrums deficients es van detectar en l'assaig i van donar valors per sota del 5%.

Deficiència	C2	C3	C4	C5	C6	C7	C8	C9	H	I
Nombre de matèries	11	1	1	2	1	2	2	1	1	2
Nombre de sèrums deficients detectats	11	1	1	2	1	2	2	1	1	2

Taula 3. La precisió entre assaigs es va determinar provant tres samples per duplicat. Els resultats es van obtenir per a sis tirades diferents

Sample	Valor mitjà %	SD	CV %
P1	91	3.3	4
P2	37	4.0	11
P3	16	2.3	15

Taula 4. La precisió intraassaig es va determinar provant un sample en 40 pous.

Assaig	Valor mitjà %	SD	CV %
MP	74	3.9	5

Resolució de problemes

Problema	Possibles causes	Solució
Valors de control fora de rang	No es barregen els reactius de temperatura, sincronització o pipeta incorrectes	Comproveu que l'hora i la temperatura siguin correctes. Repetiu la prova.
	Contaminació creuada dels controls	Pipeteu amb cura.
	La via òptica no està neta.	Comproveu si hi ha brutícia o bombolles d'aire als pous. Netegeu el fons de la placa i torneu a llegir.
	Control positiu no dissolt correctament.	Comprovar el control positiu, dissoldre a nou.
Tots els resultats de les proves són negatius	No s'han afegit un o més reactius o s'han afegit en una seqüència incorrecta.	Tornar a comprovar el procediment. Comproveu si hi ha reactius no utilitzats. Repetiu la prova.
	Placa recoberta d'antigen inactiva.	Comproveu si hi ha humitat evident als pous no utilitzats. Netegeu el fons de la placa i torneu a llegir.
	Sèrum inactiu.	Diluir nou samples.
Tots els resultats de la prova són grocs	Tampons o reactius contaminats.	Comproveu totes les solucions per terbolesa.
	Solució de rentat contaminada.	Utilitzeu un recipient net. Comproveu la qualitat de l'aigua utilitzada per preparar la solució.
	Dilució inadequada del sèrum.	Repetiu la prova.
Poca precisió	CV de lliurament de pipetes >5% o samples no barrejades.	Comproveu el calibratge de la pipeta. Utilitzeu una tècnica reproduïble. Eviteu la punta de la pipeta de bombolles d'aire.
	Sèrum o reactius no barrejats prou o no equilibrats a temperatura ambient.	Barregeu tots els reactius suaument però a fons i equilibreu-los a temperatura ambient.
	L'addició de reactius triga massa, inconsistència en els intervals de temps.	Desenvolupeu una tècnica uniforme i coherent i utilitzeu un dispositiu multipunt o un dispensador automàtic per reduir el temps.
	La via òptica no està neta.	Comproveu si hi ha bombolles d'aire als pous. Netegeu el fons de la placa i torneu a llegir.
	El rentat no és consistent, la solució de rentat de les bombolles atrapades queda als pous.	Comproveu que tots els pous s'omplen i s'aspiren de manera uniforme. Distribuïu líquid per sobre del nivell del reactiu al pou. Després de l'últim rentat, buideu els pous tocant la tira sobre un teixit absorbent.

Referències

• Walport M, Complement (Primera de dues parts) N Engl J Med 2001, 344, 1058-1066.
• Walport M, Complement (Segona de dues parts) N Engl J Med 2001, 344, 1140-1144.
• Roos A, Bouwman L, Munoz J et al. , Caracterització funcional de la via de la lectina del complement en sèrum humà. Mol Immunol 2003, 39, 655-668.
• Nordin Frediksson G, Truedsson L, Sjöholm A. Nou procediment per a la detecció de deficiència de complement per ELISA. J Imm Meth 1993, 166, 263-270.
• MA Seelen et al, Anàlisi funcional de les vies clàssiques, alternatives i MBL del sistema del complement: estandardització i validació d'un ELISA simple. J Imm Meth 2005, 296, 187-198.

Explicació dels símbols.

	Data de caducitat.
	Riscos biològics.
	Límit de temperatura.
	Fabricant.
	Codi de lot.
	Número de catàleg.
	Consulteu les instruccions d'ús.
	Avís.
	Conté suficient per a 96 proves.
	Antigen.
	Diluent.
	Conjugar.
	Solució de rentat 30x conc.
	Substrat pNPP.
	Control negatiu.
	Control positiu liofilitzat.

Atenció al client

SVAR Life Science AB
Lundavägen 151, SE-212 24 Malmö, Suècia
Telèfon: +46 40 53 76 00
Correu electrònic: info@svarlifescience.com
www.svarlifescience.com

Documents/Recursos

SVAR Life Science RUO Wieslab Complement System MBL Pathway [pdfInstruccions RUO, RUO Wieslab Complement System MBL Pathway, Wieslab Complement System MBL Pathway, Complement System MBL Pathway, System MBL Pathway, MBL Pathway, Pathway

Referències

• Manual d'usuari